Mekanisme kerja RNAi

Interferensi RNA (RNAi, dari RNA interference) merupakan salah satu mekanisme pada sel hidup untuk mengendalikan aktivitas gen. Pertama kali ia diketahui sebagai suatu proses untuk mementahkan hasil transkripsi sehingga translasi tidak dapat berlangsung. Dalam RNAi terlibat dua jenis RNA berukuran kecil miRNA dan siRNA yang berperan penting. Kedua RNA berukuran kecil ini dapat berikatan dengan RNA lain (yang komplementer dengan urutan basanya) sehingga mengganggu (meng-interferensi) proses yang melibatkan RNA tersebut, misalnya dengan mencegah terbentuknya protein/enzim. Peran penting interferensi RNA mencakup sistem pertahanan terhadap informasi genetik asing (dari virus dan transposon), mengatur proses perkembangan, dan dalam sejumlah aspek ekspresi gen lainnya.

Studi awal menunjukkan bahwa siRNA merupakan dupleks 21-26 nukleotida RNA dengan 2-nukleotida 3’ yang menggantung dan 5’ fosfat dan 3’ hidroksi sebagai terminal. 21-22 nt terlibat dalam degradasi mRNA dan memiliki ukuran yang lebih panjang, 24-26 nt mengarahkan metilasi DNA dan penghentian sistemik. Sebuah komponen RISC, domain PAZ dari Argonaute, memfasilitasi pengenalan siRNA dengan untai tunggal 3’ yang menggantung dengan bantuan enzim Dicer. Telah dikemukakan bahwa dupleks bergabung di prekursor RISC dan kemudian siRNA yang melepaskan ATP-dependent mengubah prekursor RISC menjadi RISC aktif. Rasio RISC mengandung untai antisense atau sense dari RNA yang ditentukan dengan kestabilan termodinamika dari pasangan basa 5’ terminal dari dupleks siRNA. Basa-basa di dekat ujung 5’ menyumbangkan energi pada pelekatan RNA, sedangkan pasangan basa yang dibentuk oleh pusat dan daerah 3’ dari siRNA menyediakan geometri berbentuk spiral yang dibutuhkan untuk katalisis. Domain PIWI pada Argonaute di RISC mempunyai kemiripan dengan ribonuklease H dengan sebuah motif aspartat-aspartat-glutamat yang dilindungi. Fosfat di antara nukleotida 11 dan 12 dari ujung 5’ mRNA jatuh mendekati pusat pembelahan RISC yang aktif.

miRNA yang matang merupakan endogen 22 nt RNA yang penting untuk mengarahkan mRNA dalam pembelahan atau represi translasi pada hewan dan tumbuhan. Molekul RNA yang pendek ini dihasilkan di sitoplasma Rnase III Dicer dari pre-miRNA yang berbentuk jepit rambut yang diproses oleh nuklir Rnase III Drosha. Residu 2-8 dari miRNA yang pertama berpasangan tepat dengan elemen daerah 3’ taktertranslasi  (UTR) dari RNA target. Endogen dari si RNA dan miRNA mempunyai kemiripan sehingga dua kelas dari RNA ini tidak dapat dibedakan dari komposisi kimia atau mekanisme kerjanya. Pada mamalia, siRNA dapat berfungsi seperti miRNA melalui represi ekspresi mRNA target dengan komplementer sebagian sampai kelipatan dari 3’ UTR. Daerah 5’ dari siRNA dan miRNA semuanya memainkan peran analogi dalam pengenalan target dan penggabungan RISC ke target RNA. Akan tetapi, perbedaan asal keduanya, perlindungan evolusioner, dan tipe gen yang dihentikan oleh keduanya telah diuraikan dengan jelas.

Pembentukan siRNA dimulai disitoplasma yang membelah menjadi dsRNA yang panjang oleh Dicer (multidomain enzim dari family RNase III). Sedangkan pembentukan miRNA dimulai di nucleus dimana secara endogenous dikode primer transkripsi awal miRNA (pre-miRNA) yang kemudian ditransport ke sitoplasma dan dipecah oleh Dicer. Pada tahap efektor, siRNA atau miRNA akan dirakit menjadi RNA-inducing silencing complexes (RICS). Aktivasi RICS mengandung satu single-standed (antisense) siRNA atau miRNA, yang memacu RISC ke mRNA target yang komplemen dengannya dan menginduksi pembelahan pada sisi spesifik pada mRNA. Sedangkan miRNA tidak menyebabkan degradasi pada gene komplemennya namun menyebabkan translation repression. Namun baik siRNA mauapun miRNA menghambat sintesis protein (Tang, 2005; Aiger, 2007; Lu dan Woodle, 2008)

Strategi untuk aplikasi RNAi

Terdapat beberapa cara untuk  aplikasi RNAi yaitu (1) tranfeksi RNAi ke sel,  dan RNAi yang ditranfeksi diharapkan akan menjadi RISC yang dapat mendegradasi mRNA target, (2)  melalui vektor plasmid,  pada nukleus diharapkan terjadi trankripsi shRNA atau pre-miRNA dan akan diproses dan diekpor ke sitoplasma menjadi RISC, (3) dengan vektor viral  DNA (Davidson dan Paulson, 2004). 

Dalam sistem aplikasi RNAi baik melalui siRNA maupun miRNA terdapat faktor-faktor yang harus diperhatikan yaitu dari ukuran RNAi, ukuran vektor, vektor yang digunakan, cara aplikasi, sistem proteksi agar siRNA yang dibawa tidak di degradasi, eliminasi, distribusi yang tidak spesifik, serta internalisasi (David et al., 2010).

Daftar Pustaka Tambahan

Aigner A. 2007. Applications Of Rna Interference: Current State And Prospects For Sirna-Based Strategies In Vivo. Appl Microbiol Biotechnol, 76:9–21.

Davidson, B.L., dan Paulson, H.L., 2004.  Molecular Medicine For The Brain: Silencing Of Disease Genes With Rna Interference. Lancet Neurol , 3: 145–149

David, S.,  Pitard, B.,  Benoît, J-P.,  Passirani, C.,  2010. Non-Viral Nanosystems For Systemic Sirna Delivery. Pharmacological Research. 62: 100–114

Lee, S-K., Dan Kumar, P., 2009. Conditional Rnai: Towards A Silent Gene Therapy.  Advanced Drug Delivery Reviews.  61:650–664

Love, T.M., Moffett, H.F., Dan Novine, C.D., 2008. Not Mir-Ly Small Rnas: Big Potential For Micrornas In Therapy.  J Allergy Clin Immunol. 121( 2 ): 309-319

Lu, PY., dan  Woodle, MC., 2008. Delivering Small Interfering Rna For Novel Therapeutics. Methods Mol Biol. 437:93–107.

Pekarik, V, 2005. Design Of Shrnas For Rnai—A Lesson From Pre-Mirna Processing: Possible Clinical Applications. Brain Research Bulletin 68:115–120

Tang G. Sirna dan  Mirna, 2005, An Insight Into RICSs. Trends Biochem Sci. 30:106–14.