Laporan Mikologi Pembuatan Media

ACARA I

Pembuatan Media

I.     Pendahuluan

A.  Latar Belakang

Di bumi kita ini selain terdapat makhluk hidup yang menempati, juga terdapat mikroorganisme. Contohnya seperti jasad renik. Untuk itu kita mempelajari pembuatan medium pertumbuhan agar bakteri patogen dapat dibiakan dengan baik maka diperlukan tempat (media) yang memungkinkan tumbuh dengan optimal. Oleh karena itu media pembiakan harus mengandung cukup nutrien untuk pertumbuhan bakteri (Pelczar, 1986).

Bakteri-bakteri ini hidup bebas di alam, tidak tergantung pada organisme lainnya. Bakteri yang hanya menggunakan senyawa organik sebagai sumber C-nya disebut bakteri heterotof. Dalam pembuatan media penumbuhan bakteri harus sesuai dengan jenis bakteri itu sendiri, supaya bakteri yang ditanam tumbuh subur (Waluyo, 2005). Dalam hal ini medium kultur merupakan suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrient yang digunakan untuk kultivasi mikroorganisme, maka medium kultur harus mengandung semua nutrient yang diperlukan dalam keadaan seimbang, tidak mengandung zat-zat penghambat, dalam keadaan steril yang diekstraksi dari bahan yang bernutrient dengan air (Bambang, 2015).

Media biakan adalah media steril yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme dengan memberikan tempat dan kondisi yang mendukung untuk pertumbuhan mikroorganisme tersebut. Media biakan terdiri dari garam organik, sumber energi (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT).  Selain itu, dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa kompleks lainnya (Soeryowinoto, 1985).

Jenis yang termasuk garam-garam anorganik berupa nitrogen terutama kalium nitrat (KNO₃), belerang (sulfur anorganik), fosfor dan unsur-unsur logam anorganik seperti natrium, kalium, kalsiuum, magnesium, mangan, besi, seng, tembaga, dan kobalt (Hendaryono 1994). Unsur karbon yang digunakan oleh mikroorganisme dapat berupa pancaran atau cahaya yang disebut fototrof dan jenis kemototrof yang menggunakan hasil oksidasi senyawa-senyawa kimia dalam media untuk memperoleh energinya (Hadioetomo dkk. 1986). Vitamin dalam media biakan berfungsi membentuk substansi yang mengaktivasi enzim.  Mikroorganisme memperlihatkan gejala yang berlainan dalam pola pengambilan nutrisi.  Meskipun semua mikroorganisme membutuhkan vitamin dalam proses metaboliknya, ada beberapa jenis mikroorganisme yang mampu mensintesis kebutuhan vitaminnya sendiri dari senyawa-senyawa lain di dalam medium (Hadioetomo dkk. 1986). Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik bukan hara dalam jumlah sedikit tetapi dapat mendukung, menghambat dan merubah proses fisiologi tumbuhan.  Zat tersebut sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan mikroorganisme sangat terhambat bahkan mungkin tidak dapat tumbuh sama sekali (Hadioetomo dkk. 1986).

Berdasarkan komposisi nutrisinya, media terbagi menjadi tiga macam yaitu media alam, media semi sintetik dan media sintetik. Komposisi media alam tidak dapat diketahui dengan pasti setiap waktu karena dapat berubah-ubah dalam bahan yang digunakan dan bergantung pada asalnya, misalnya jagung, kentang, serangga dan rambut. Media semi sintetik terdiri dari campuran antara bahan alami dengan bahan kimia yang komposisinya dapat diketahui secara pasti, misalnya Potato Dextrose Agar (PDA). Media sintetik terbuat dari bahan kimia yang komposisi dan konsentrasinya dapat diketahui dengan pasti, misalnya Czapek’s Agar (Gunawan dkk. 2006). Untuk isolasi mikroorganisme umumnya digunakan empat macam media, yaitu media umum, media elektif, media selektif dan media diferensial.

B.       Tujuan

Memberikan Keterampilan kepada mahasiswa dalam pembuatan media.

II.  Metode

A.  Alat dan Bahan

Petridish, Laminar Air Flow, bunsen, plastik sheel, media PDA, akuades.

B.  Cara Kerja

1.    Media PDA cair yang sudah disiapkan dituang secara steril dengan pemanasan bagian ujung enlenmeyer dengan api bunsen.

2.    Secara cepat dituang kurang lebih 15-20 ml media ke petridish.

3.    Petridish ditutup sebagian dan dibiarkan kurang lebih 15-20 menit atau sampai media menjadi padat.

4.    Media siap digunakan

III.   Hasil dan Pembahasan

A.    Hasil

Media yang telah dituang ke dalam cawan petri

B.     Pembahasan

Cendawan merupakan suatu mikroorganisme yang memiliki kemampuan untuk tumbuh (berkembang) dan memperbanyak diri di alam. Selain itu, beberapa cendawan ada yang dapat berkembang dalam suatu media buatan. Media buatan tersebut disesuaikan dengan karakteristik tiap cendawan, terutama kandungan nutrisinya karena tiap cendawan memiliki kebutuhan nutrisi yang berbeda. Media biak cendawan terbagi menjadi 3 macam berdasarkan komposisi nutrisinya, yaitu media alami, media semi alami (semi sintetik) dan media sintetik.

Pada praktikum pertama ini sudah tersedia PDA yang bisa langsung dituang ke dalam cawan petri. Media PDA yang sudah dibuat sebelumnya dipanasi terlebih dahulu kemudian dituang ke dalam cawan petr dalam keadaan aseptis di dalam laminar air flow. Setelah dituang ke dalam cawan petri media PDA ditunggu hingga kembali membeku dan disimpan di dalam suhu ruangan. Cara penyimpanannya adalah membungkus media tersebut menggunakan kertas merang dan dibungkus kembali dengan menggunakan plastik.

Medium APDA adalah salah satu dari medium untuk proses menumbuhkan mikrobia. APDA merupakan medium yang berkomposisi kentang, dextrose, dan asam tartarat. APDA tidak bersifat umum seperti NA karena tidak semua mikrobia dapat tumbuh pada medium ini.  Medium APDA termasuk ke dalam medium yang padat sehingga dapat membentuk koloni mikroba yang dapat dilihat dan dihitung, jika diinokulasikan di dalam medium APDA, bakteri anaerob akan tumbuh mengelompok pada dasar medium, bakteri yang anaerob fakultatif akan tumbuh tersebar di seluruh medium, bakteri mikroaerofil akan tumbuh mengelompok sedikit di bawah permukaan medium, sedangkan bakteri aerob akan tumbuh pada permukaan medium (Dwidjoseputro, 1994). Medium ini digunakan untuk isolasi bakteri, hasilnya dinyatakan dalam jumlah koloni yang didapatkan nantinya. Medium ini sangat diperlukan untuk mempelajari ciri-ciri koloni, sifat-sifat biokimia, morfologi, reaksi pengecatan, reaksi imunologi dan ketentraman bakteri terhadap zat antibakteri. Pembuatan medium APDA dapat dilakukan dengan serangkaian cara mulai dari pembuatan PDA hingga pencampurannya dengan asam tartarat (Irianto, 2010).

Pada praktikum ini, praktikan membuat suatu media semi alami (semi sintetik), yaitu media PDA (Potato Dextrose Agar). PDA merupakan suatu media yang dibuat dengan menggunakan bahan alami dan bahan kimia yang komposisinya dapat diketahui secara pasti. Bahan alami media ini adalah kentang dan bahan kimianya adalah gula dan agar-agar. Sumber nutrisi untuk menunjang pertumbuhan cendawan dalam media PDA adalah kentang (ekstrak), agar-agar dan gula.

Media PDA yang dapat digunakan untuk menangkap dan menumbuhkan cendawan harus memenuhi kebutuhan nutrisi dan kondisi lingkungan yang dibutuhkan cendawan tersebut. Selain itu, media PDA yang digunakan tidak boleh terkontaminasi oleh mikroorganisme lainnya seperti bakteri. Media yang terkontaminasi biasanya disebabkan oleh kesalahan pada saat pensterilan di dalam autoklaf sehingga terdapat mikroorganisme lain seperti bakteri dalam media yang dapat mengganggu dan menghambat pertumbuhan cendawan yang diinginkan. Pembuatan media harus dilakukan sesuai dengan prosedur yang ada dan teliti agar media tersebut tidak terkontaminasi.

Media PDA yang telah dibuat oleh praktikan cukup baik dan tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme lain sehingga media tersebut dapat digunakan untuk menangkap dan menumbuhkan mikroba. Media PDA yang telah dibuat dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Untuk mencegah kontaminasi mikroorganisme lain seperti bakteri dalam media PDA, sebaiknya penuangan media (dalam tabung Erlenmeyer) tersebut ke dalam cawan petri dilakukan dalam Laminar Air Flow dan langsung ditutup kembali dengan alumunium foil secara rapat sehingga dapat digunakan lagi pada waktu lain.

IV.   Kesimpulan

Media PDA yang dapat digunakan untuk menangkap dan menumbuhkan cendawan harus memenuhi kebutuhan nutrisi dan kondisi lingkungan yang dibutuhkan cendawan tersebut. Selain itu, media PDA yang digunakan tidak boleh terkontaminasi oleh mikroorganisme lainnya seperti bakteri. Media dibuat secara aseptis.

Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-dasar Mikrobiologi.Jakarta: Djambatan.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Gunawan AW, dkk. 2006. Cendawan dalam Praktek Laboratorium. Bogor:            IPB Press.

Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo S, Sri LA. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi    Jilid I. Jakarta: UI Press.

Hendaryono DPS. 1994. Teknik Kutur Jaringan. Jakarta: Kanisius.

Irianto, K. 2010. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I. 

Pelczar, 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1 untuk Perguruan Tinggi. Universitas Indonesia: Jakarta.

Purnomo, Bambang. 2015. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Fakultas Pertanian UNIB. Bengkulu.

Soeryowinoto M. 1985. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Yogyakarta: Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum Cetakan Kedua. UMM Press. Malang.

Read More

Mekanisme kerja RNAi

Interferensi RNA (RNAi, dari RNA interference) merupakan salah satu mekanisme pada sel hidup untuk mengendalikan aktivitas gen. Pertama kali ia diketahui sebagai suatu proses untuk mementahkan hasil transkripsi sehingga translasi tidak dapat berlangsung. Dalam RNAi terlibat dua jenis RNA berukuran kecil miRNA dan siRNA yang berperan penting. Kedua RNA berukuran kecil ini dapat berikatan dengan RNA lain (yang komplementer dengan urutan basanya) sehingga mengganggu (meng-interferensi) proses yang melibatkan RNA tersebut, misalnya dengan mencegah terbentuknya protein/enzim. Peran penting interferensi RNA mencakup sistem pertahanan terhadap informasi genetik asing (dari virus dan transposon), mengatur proses perkembangan, dan dalam sejumlah aspek ekspresi gen lainnya.

Studi awal menunjukkan bahwa siRNA merupakan dupleks 21-26 nukleotida RNA dengan 2-nukleotida 3’ yang menggantung dan 5’ fosfat dan 3’ hidroksi sebagai terminal. 21-22 nt terlibat dalam degradasi mRNA dan memiliki ukuran yang lebih panjang, 24-26 nt mengarahkan metilasi DNA dan penghentian sistemik. Sebuah komponen RISC, domain PAZ dari Argonaute, memfasilitasi pengenalan siRNA dengan untai tunggal 3’ yang menggantung dengan bantuan enzim Dicer. Telah dikemukakan bahwa dupleks bergabung di prekursor RISC dan kemudian siRNA yang melepaskan ATP-dependent mengubah prekursor RISC menjadi RISC aktif. Rasio RISC mengandung untai antisense atau sense dari RNA yang ditentukan dengan kestabilan termodinamika dari pasangan basa 5’ terminal dari dupleks siRNA. Basa-basa di dekat ujung 5’ menyumbangkan energi pada pelekatan RNA, sedangkan pasangan basa yang dibentuk oleh pusat dan daerah 3’ dari siRNA menyediakan geometri berbentuk spiral yang dibutuhkan untuk katalisis. Domain PIWI pada Argonaute di RISC mempunyai kemiripan dengan ribonuklease H dengan sebuah motif aspartat-aspartat-glutamat yang dilindungi. Fosfat di antara nukleotida 11 dan 12 dari ujung 5’ mRNA jatuh mendekati pusat pembelahan RISC yang aktif.

miRNA yang matang merupakan endogen 22 nt RNA yang penting untuk mengarahkan mRNA dalam pembelahan atau represi translasi pada hewan dan tumbuhan. Molekul RNA yang pendek ini dihasilkan di sitoplasma Rnase III Dicer dari pre-miRNA yang berbentuk jepit rambut yang diproses oleh nuklir Rnase III Drosha. Residu 2-8 dari miRNA yang pertama berpasangan tepat dengan elemen daerah 3’ taktertranslasi  (UTR) dari RNA target. Endogen dari si RNA dan miRNA mempunyai kemiripan sehingga dua kelas dari RNA ini tidak dapat dibedakan dari komposisi kimia atau mekanisme kerjanya. Pada mamalia, siRNA dapat berfungsi seperti miRNA melalui represi ekspresi mRNA target dengan komplementer sebagian sampai kelipatan dari 3’ UTR. Daerah 5’ dari siRNA dan miRNA semuanya memainkan peran analogi dalam pengenalan target dan penggabungan RISC ke target RNA. Akan tetapi, perbedaan asal keduanya, perlindungan evolusioner, dan tipe gen yang dihentikan oleh keduanya telah diuraikan dengan jelas.

Pembentukan siRNA dimulai disitoplasma yang membelah menjadi dsRNA yang panjang oleh Dicer (multidomain enzim dari family RNase III). Sedangkan pembentukan miRNA dimulai di nucleus dimana secara endogenous dikode primer transkripsi awal miRNA (pre-miRNA) yang kemudian ditransport ke sitoplasma dan dipecah oleh Dicer. Pada tahap efektor, siRNA atau miRNA akan dirakit menjadi RNA-inducing silencing complexes (RICS). Aktivasi RICS mengandung satu single-standed (antisense) siRNA atau miRNA, yang memacu RISC ke mRNA target yang komplemen dengannya dan menginduksi pembelahan pada sisi spesifik pada mRNA. Sedangkan miRNA tidak menyebabkan degradasi pada gene komplemennya namun menyebabkan translation repression. Namun baik siRNA mauapun miRNA menghambat sintesis protein (Tang, 2005; Aiger, 2007; Lu dan Woodle, 2008)

Strategi untuk aplikasi RNAi

Terdapat beberapa cara untuk  aplikasi RNAi yaitu (1) tranfeksi RNAi ke sel,  dan RNAi yang ditranfeksi diharapkan akan menjadi RISC yang dapat mendegradasi mRNA target, (2)  melalui vektor plasmid,  pada nukleus diharapkan terjadi trankripsi shRNA atau pre-miRNA dan akan diproses dan diekpor ke sitoplasma menjadi RISC, (3) dengan vektor viral  DNA (Davidson dan Paulson, 2004). 

Dalam sistem aplikasi RNAi baik melalui siRNA maupun miRNA terdapat faktor-faktor yang harus diperhatikan yaitu dari ukuran RNAi, ukuran vektor, vektor yang digunakan, cara aplikasi, sistem proteksi agar siRNA yang dibawa tidak di degradasi, eliminasi, distribusi yang tidak spesifik, serta internalisasi (David et al., 2010).

Daftar Pustaka Tambahan

Aigner A. 2007. Applications Of Rna Interference: Current State And Prospects For Sirna-Based Strategies In Vivo. Appl Microbiol Biotechnol, 76:9–21.

Davidson, B.L., dan Paulson, H.L., 2004.  Molecular Medicine For The Brain: Silencing Of Disease Genes With Rna Interference. Lancet Neurol , 3: 145–149

David, S.,  Pitard, B.,  Benoît, J-P.,  Passirani, C.,  2010. Non-Viral Nanosystems For Systemic Sirna Delivery. Pharmacological Research. 62: 100–114

Lee, S-K., Dan Kumar, P., 2009. Conditional Rnai: Towards A Silent Gene Therapy.  Advanced Drug Delivery Reviews.  61:650–664

Love, T.M., Moffett, H.F., Dan Novine, C.D., 2008. Not Mir-Ly Small Rnas: Big Potential For Micrornas In Therapy.  J Allergy Clin Immunol. 121( 2 ): 309-319

Lu, PY., dan  Woodle, MC., 2008. Delivering Small Interfering Rna For Novel Therapeutics. Methods Mol Biol. 437:93–107.

Pekarik, V, 2005. Design Of Shrnas For Rnai—A Lesson From Pre-Mirna Processing: Possible Clinical Applications. Brain Research Bulletin 68:115–120

Tang G. Sirna dan  Mirna, 2005, An Insight Into RICSs. Trends Biochem Sci. 30:106–14.

Read More